本发明公开了一种6-羧基荧光素的制备方法，所述的方法包括以下步骤：a、反应步骤；b、结晶步骤；c、水解步骤。本发明与现有技术相比，使用金属催化剂四氯化锡（SnCl
1.一种6-羧基荧光素的制备方法，包括以下步骤：a、反应步骤；b、结晶步骤；c、水解步骤；xa0所述的a、反应步骤：xa0室温下，在反应容器中，将间苯二酚类物质溶于甲基磺酸，再加入偏苯三酸酐，室温搅拌均匀，加入四氯化锡，升温至90-110℃，保温6-10小时后，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；xa0偏苯三酸酐、间苯二酚类物质、四氯化锡的摩尔比为1：2：0.2-0.22；xa0所述的b、结晶步骤：xa0将反应溶液倒入冰水溶液中，搅拌10-15分钟，产物沉淀析出，过滤，干燥，再用体积比为1:4甲醇和己烷混合溶液进行重结晶，过滤，干燥，得到6-羧基荧光素甲基磺酸加合物；xa0所述的c、水解步骤：xa0将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4Mxa0NaOH水溶液中，室温搅拌1-2小时后，得到6-羧基荧光素钠盐；6-羧基荧光素甲基磺酸加合物与NaOH的摩尔比为1:1.2-1.3；xa0再将6-羧基荧光素钠盐溶液加入6Nxa0HCl水溶液中，室温搅拌1-2小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式6-羧基荧光素，6-羧基荧光素钠盐与HCl的摩尔比为1：0.5-0.6；所述间苯二酚类物质选自间苯二酚、4-氯间苯二酚、4-甲基间苯二酚中的一种。xa0技术领域
本发明属于6-羧基荧光素的制备方法，具体涉及选择性金属催化制备6-羧基荧光素的制备方法。xa0
背景技术
6-羧基荧光素作为一种广泛使用的荧光染料，其相关衍生物可与蛋白、抗体，多肽，核酸和磷脂等生物大分子结合，广泛应用于生物科学和医药研究，如用于核酸探针，实时PCRxa0和药物靶标标记技术等。但是，现有制备6-羧基荧光素的方法中，有一个共同的难题，就是在生成6-羧基荧光素的同时，有约等量的5-羧基荧光素生成xa0(参考文献：Yuichiroxa0Ueno,xa0Guan-Shengxa0Jiaoxa0&xa0Kevinxa0Burgess,xa0Synthesis,xa02004xa0(15),xa02591-2593)。由于5-羧基荧光素与6-羧基荧光素互为位置异构体,xa0性质很相近，当反应产物的组成比例为6-羧基荧光素：5-羧基荧光素近为1:1xa0时，将使分离6-羧基荧光素与5-羧基荧光素相当困难。即使分离，由于两异构体相互交叉，损失较大，产率较低。xa0
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于一种制备6-羧基荧光素的新工艺方法。xa0本发明解决技术问题的技术方案为：一种6-羧基荧光素的制备方法，包括以下步骤：xa0a、反应步骤：xa0室温下，在反应容器中，将间苯二酚类物质溶于甲基磺酸，再加入偏苯三酸酐，室温搅拌均匀，加入四氯化锡，升温至90-110?C，保温6-10小时后，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；xa0偏苯三酸酐、间苯二酚类物质、四氯化锡的摩尔比为1：2：0.2-0.22xa0b、结晶步骤xa0将反应溶液倒入冰水溶液中，搅拌10-15分钟，xa0产物沉淀析出，过滤，干燥，再用甲醇和己烷混合溶液（甲醇：己烷的体积比为1:xa04）进行重结晶，过滤，干燥，得到6-羧基荧光素甲基磺酸加合物；xa0c、水解步骤：xa0将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4xa0Mxa0NaOH水溶液中，室温搅拌1-2小时后，得到6-羧基荧光素钠盐；6-羧基荧光素甲基磺酸加合物与NaOH的摩尔比为1:xa01.2-1.3；xa0再将6-羧基荧光素钠盐溶液加入6xa0Nxa0HClxa0水溶液中，室温搅拌1-2小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式6-羧基荧光素，xa06-羧基荧光素钠盐与HCl的摩尔比为1：0.5-0.6。xa0所述的间苯二酚类物质的结构式如下：xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="216"/>在式中，R₁、R₂xa0为氢、卤素、烷基。xa0本发明的反应原理如下：xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>本发明使用金属催化剂四氯化锡（SnCl₄）选择性催化反应，制备6-羧基荧光素，在分离纯化中选择合适的混合溶剂的比例及纯化方法，将所需产物6-羧基荧光素与副产物5-羧基荧光素比例从1:1提高到2.6:1,xa0分离产率提高到原来的1.9倍xa0(从32%提高到61%左右)。大大降低了生产成本，减化了提纯过程，xa0为制备广泛用于荧光标记生物大分子的6-羧基荧光素及其衍生物提供了一种高效实用的新工艺方法，具有很高的应用价值。xa0
具体实施方式
实施例1：xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>a、反应步骤：xa0室温下，在反应容器中，将间苯二酚2xa0(resorcinol,xa057.2xa0g,xa00.52xa0mol)xa0溶于甲基磺酸(methanesulfonicxa0acidxa0,xa0520xa0ml)xa0中，加入偏苯三酸酐xa01xa0(1,2,4-benzenetricarboxylicxa0anhydride,xa050xa0g,xa00.26xa0mol)，xa0室温搅拌10分钟后，加入四氯化锡xa0(SnCl₄,xa06.1xa0ml,xa00.055xa0mol)，加热，在90xa0?C下反应，6小时后，HPLC表明反应完全，xa0停止反应，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；xa0b、结晶步骤xa0将反应溶液倒入4xa0升冰水溶液中，搅拌10分钟，xa0产物沉淀析出。过滤，干燥，干燥后的粗产物用甲醇和己烷（甲醇：己烷xa0体积比为1:xa04）进行结晶。过滤，干燥，xa0得6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。xa0c、水解步骤：xa0将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4xa0Mxa0NaOH水溶液80毫升，在室温处搅拌1小时后，得到6-羧基荧光素钠盐。xa0将6-羧基荧光素的钠盐溶液加入6xa0Nxa0HClxa0水溶液22毫升，在室温搅拌1小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式6-羧基荧光素(简称6-羧基荧光素或6-FAM),xa059.1xa0克，HPLCxa0纯度为98%,产率为61%。xa06-羧基荧光素的结构通过UV;xa0xa0¹Hxa0NMR;xa0LC-MSxa0(M^–)xa0来证实。xa06-羧基荧光素:xa0xa0λexxa0=xa0492xa0nm;xa0λemxa0=xa0517xa0nmxa0inxa00.1xa0Mxa0Trisxa0pHxa08.0.xa0紫外吸收.xa0λmaxxa0=xa0492xa0nmxa0inxa00.1xa0Nxa0NaOH;xa0xa0¹Hxa0NMRxa0(DMSO-d₆,xa0400xa0MHz)xa0xa0–,xa0计算值xa0C₂₁H₁₁O₇,xa0375.32;xa0实测值xa0375.2.xa0实施例2：xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>a、反应步骤：xa0室温下，在反应容器中，将4-氯间苯二酚3xa0(4-Chlororesorcinol,xa075.2xa0g,xa00.52xa0mol)xa0溶于甲基磺酸(methanesulfonicxa0acidxa0,xa0620xa0ml)xa0中，加入偏苯三酸酐xa01xa0(1,2,4-benzenetricarboxylicxa0anhydride,xa050xa0g,xa00.26xa0mol)，xa0室温搅拌15分钟后，加入四氯化锡xa0(SnCl₄,xa06.7xa0ml,xa00.057xa0mol)，加热，在105xa0?C下反应，6小时后，HPLC表明反应完全，xa0停止反应，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；xa0b、结晶步骤xa0将反应溶液倒入4xa0升冰水溶液中，搅拌10分钟，xa0产物沉淀析出。过滤，干燥，干燥后的粗产物用甲醇和己烷（甲醇：己烷xa0体积比为1:xa04）进行结晶。过滤，干燥，xa0得2’,7’-二氯-6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。xa0c、水解步骤：xa0将6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4xa0Mxa0NaOH水溶液84毫升，在室温处搅拌2小时后，得到2’,7’-二氯-6-羧基荧光素钠盐。xa0将2’,7’-二氯-6-羧基荧光素钠盐溶液加入6xa0Nxa0HClxa0水溶液26毫升，在室温搅拌1小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式2’,7’-二氯-6-羧基荧光素,xa071.6克，HPLCxa0纯度为97%,产率为60%。xa06-羧基荧光素的结构通过UV;xa0¹Hxa0NMR;xa0LC-MSxa0(M^–)xa0来证实。xa06-羧基荧光素:xa0xa0λexxa0=xa0498xa0nm;xa0λemxa0=xa0521xa0nmxa0inxa00.1xa0Mxa0Trisxa0pHxa08.0.xa0紫外吸收.xa0λmaxxa0=xa0498xa0nmxa0inxa00.1xa0Nxa0NaOH;xa0xa0¹Hxa0NMRxa0(DMSO-d₆,xa0400xa0MHz)xa0–,xa0计算值xa0C₂₁H₉Clxa0₂O₇,xa0444.21;xa0实测值xa0444.2.xa0实施例3：xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>a、反应步骤：xa0室温下，在反应容器中，将4-甲基间苯二酚4xa0(4-methylresorcinol,xa064.6xa0g,xa00.52xa0mol)xa0溶于甲基磺酸xa0(methanesulfonicxa0acidxa0,xa0600xa0ml)xa0中，加入偏苯三酸酐xa01xa0(1,2,4-benzenetricarboxylicxa0anhydride,xa050xa0g,xa00.26xa0mol)，xa0室温搅拌10分钟后，加入四氯化锡xa0(SnCl₄,xa05.8xa0ml,xa00.052xa0mol)，加热，在95xa0?C下反应，6小时后，HPLC表明反应完全，xa0停止反应，将反应体系冷至室温，得到反应溶液；xa0b、结晶步骤xa0将反应溶液倒入4xa0升冰水溶液中，搅拌10分钟，xa0产物沉淀析出。过滤，干燥，干燥后的粗产物用甲醇和己烷（甲醇：己烷xa0体积比为1:xa04）进行结晶。过滤，干燥，xa0得2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素甲基磺酸加合物。xa0c、水解步骤：xa0将2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素甲基磺酸加合物加入4xa0Mxa0NaOH水溶液80毫升，在室温处搅拌1小时后，得到2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素钠盐。xa0将6-羧基荧光素的钠盐溶液加入6xa0Nxa0HClxa0水溶液22毫升，在室温搅拌1小时后，产物沉淀析出，干燥至恒重，得到自由酸式2’,7’-二甲基-6-羧基荧光素,xa066.5克，HPLCxa0纯度为98%,产率为62%。xa02’,7’-二甲基-6-羧基荧光素的结构通过UV;xa0xa0¹Hxa0NMR;xa0LC-MSxa0(M^–)xa0来证实。xa02’,7’-二甲基-6-羧基荧光素:xa0xa0λexxa0=xa0502xa0nm;xa0λemxa0=xa0527xa0nmxa0inxa00.1xa0Mxa0Trisxa0pHxa08.0.xa0紫外吸收.xa0λmaxxa0=xa0502xa0nmxa0inxa00.1xa0Nxa0NaOH;xa0xa0¹Hxa0NMRxa0(DMSO-d₆,xa0400xa0MHz)xa0(ppm)xa08.3xa0(s,xa01xa0H),xa08.26xa0(d,xa01xa0H),xa08.21xa0(d,xa01H),xa07.5xa0(2xa0H),xa06.3(2H),xa02.2xa0(s,xa06H);xa0xa0LC-MS:xa0m/zxa0forxa0(M-H)xa0–,xa0计算值xa0C₂₃H₁₅O₇,xa0403.37;xa0实测值xa0403.3。xa0